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基于液质联用技术的大豆主要致敏原蛋白检测方法研究

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  • 【题名】:基于液质联用技术的大豆主要致敏原蛋白检测方法研究
  • 【年份】:2020
  • 【作者】:李丽芳
  • 【关键词】:大豆  致敏原蛋白  液质联用  多反应监测  大豆样品检测
  • 【摘要】:大豆(Glycine max[L.]Merr.)富含蛋白质和油脂等营养元素,是一种重要的食品原料;同时其富含致敏原蛋白,是世界卫生组织(WHO)认定的“八大食物致敏原”之一。大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白是大豆中含量最高的致敏原蛋白。目前,部分致敏原蛋白尚无有效的定量方法,而各种致敏原蛋白的相对含量及其在大豆品种间的表达变异性尚不清楚。现有的大豆致敏原检测方法主要是ELISA法和PCR法,但这两类方法均存在特异性差、检测通量低和准确性差等局限性。近年来,高效液相色谱-串联质谱联用(High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)技术被广泛应用于食品中多种致敏原蛋白及其多肽的鉴定和定量分析。本研究旨在应用HPLCMS/MS技术,建立快速、灵敏、准确的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白准确定性和精确定量检测方法。主要研究内容和结果如下:(1)建立了针对大豆球蛋白(包括G1、G2、G3、G4和G5亚基)和β-伴大豆球蛋白(包括α′、α和β亚基)的8种致敏原亚基的HPLC-MS/MS定性检测方法。通过优化提取条件,最终确定适用于本试验的大豆蛋白最佳提取方案(缓冲液为pH为10.0的超纯水,料液比为1 g∶10 mL,提取温度50℃,提取时间60 min);通过高分辨质谱对大豆全蛋白酶解肽进行分析,利用Skyline软件与UniProtKB大豆蛋白数据库完成肽段检索,针对大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的8种致敏原亚基,分别筛选到2~3条特征肽段(共计21条),其中10条为本研究首次报道;在多反应监测(MRM)模式下对15个阴性对照和24个阳性对照进行靶向蛋白组学检测,完成所选特征肽段的特异性验证,最终建立同时检测大豆中8种致敏原亚基的HPLC-MS/MS方法。(2)建立了针对大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白8种致敏原亚基的HPLC-MS/MS定量检测方法。通过优化酶解条件,确定最佳的酶解时间为6 h;优化各特征肽段的碰撞能量(CE)和去簇电压(DP)等参数,提高了其质谱响应强度;优化液相色谱流动相梯度洗脱条件,提高了分离效率;确定了大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的各致敏原亚基的定量特征肽段,设计合成了稳定同位素标记的定量特征肽段,建立了灵敏、准确的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的HPLC-MS/MS定量分析方法;进行了方法学验证,方法的检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.4~200.0 fmol/μL和0.8~400.0 fmol/μL,回收率在98.75%~110.23%之间,日内变异系数在2.1%~4.8%之间,日间变异系数在2.6%~3.8%范围内,可满足实际检测要求。(3)对128份大豆种质的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量进行了定量分析。采用本文建立的方法提取全蛋白,参试样品的全蛋白含量在283.38~420.68 mg/g之间;并对大豆样品中大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白各致敏原亚基的含量进行测定,在128份大豆样品中未发现亚基缺失种质;8种致敏原亚基的含量由高至低(以平均值计)依次为G1亚基>G2亚基>α′亚基>α亚基>β亚基>G4亚基>G5亚基>G3亚基,通过各亚基含量加和计算得到大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白的含量分别在102.79~156.36mg/g和66.08~121.18 mg/g范围内,品种间差异显著,且其比值的变异系数在不同生态区间也存在差异。大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白既是大豆的主要致敏原,也是大豆加工特性的关键影响要素。本文研究建立的定量分析方法为大豆过敏阈值研究、脱敏治疗等提供了技术基础,为食物致敏原的正确标识提供了技术保障,并将在低致敏性大豆、高蛋白大豆的品种培育等方面发挥重要作用。
  • 【会议名称】:硕士
  • 【类别名称】:韩晓祥
  • 【载体】:浙江工商大学
  • 【会议地点】:2020
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