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基于适配体—纳米金双模式生物传感器的鱼小清蛋白快速检测研究

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  • 【题名】:基于适配体—纳米金双模式生物传感器的鱼小清蛋白快速检测研究
  • 【年份】:2020
  • 【作者】:戚琴芹
  • 【关键词】:小清蛋白  核酸适配体  金纳米粒子  双模式生物传感器
  • 【摘要】:近年来,由于经济的快速发展和人民生活水平的提高,食物过敏日益受到消费者的重视。其中,鱼类由于味道鲜美、来源广泛、营养经济价值高而受到广大消费者的欢迎,但鱼却是易引起食物过敏反应的八大类食品之一。报道显示,13%以上的食物过敏由鱼类引起,而其中90%是由鱼类中的小清蛋白导致。小清蛋白具有很强的耐高温、耐酶解特性,难以通过普通的食品加工及烹饪过程消除其致敏原性。目前,小清蛋白的定量检测方法主要有ELISA法和PCR法。然而,这两类方法均存在前处理复杂、操作成本高、测试时间长等一系列局限性。基于上述问题,本研究旨在构建一种可以快速、准确检测小清蛋白的双模式生物传感器。主要研究内容如下:(1)通过组合浸提、硫酸铵沉淀和DEAE离子交换层析等方法提取及纯化鳕鱼中的小清蛋白。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、ELISA及免疫印迹技术分析表征目标纯化蛋白的性质,并结合质谱对小清蛋白进行确证。结果显示,经上述方法提取的小清蛋白的纯度达99%以上,分子量为11.5 kDa,具有较强的免疫活性反应。(2)采用免固定化氧化石墨烯筛选法(GO-SELEX),在随机ssDNA文库中筛选能够特异性识别小清蛋白的核酸适配体。采用正筛、反筛和负筛三种方式共计开展18轮筛选,经由高通量测序获得候补序列。采用DNAMAN对上述序列进行家族性、同源性分析及二级结构鉴定,并选出6条较优适配体进行生物膜干涉技术(BLI)亲和力测试及荧光氧化石墨烯特异性分析,最终获得一条兼具良好亲和力和特异性的适配体。(3)采用巯基化适配体DNA1及其互补短链DNA2分别修饰纳米金,构建AuNPs-DNA1和AuNPs-DNA2探针,并与第三条荧光标记适配体互补短链DNA3杂交形成组装体,建立具有可见光及荧光双模式信号的生物传感平台。当样品中存在鱼小清蛋白时,其会竞争结合纳米金组装体中带有适配体的AuNPs-DNA1,促使纳米金组装体解组装,这一方面会带来可见光信号的变化,另一方面会通过释放荧光标记互补DNA3,使原本因FRET效应而被淬灭的荧光信号恢复。研究结果显示,该生物传感器能够通过比色法定性分析大于2.5μg/mL小清蛋白的存在,同时可通过荧光法在小清蛋白含量0~40μg/mL范围内获得良好线性关系,其标准曲线回归方程为y=30986x+24750,相关系数R~2=0.9939。稳定性、准确度及特异性等方法学考察证明该方法具有较好的可靠性。由此可见,该生物传感器可实现基于可见光及荧光信号的定性、定量双模式检测,在食品致敏原检测中具有极大的应用前景。
  • 【会议名称】:硕士
  • 【类别名称】:王彦波
  • 【载体】:浙江工商大学
  • 【会议地点】:2020
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