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七氟醚后处理调节海马区自噬及溶酶体系统在改善缺血缺氧新生大鼠脑损伤预后的机制研究

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  • 【题名】:七氟醚后处理调节海马区自噬及溶酶体系统在改善缺血缺氧新生大鼠脑损伤预后的机制研究
  • 【年份】:2019
  • 【作者】:薛杭
  • 【关键词】:七氟醚  缺血缺氧性脑病  新生大鼠  Ezh2  Pten/Akt/mTOR  自噬  小胶质细胞  cathepsinB
  • 【摘要】:目的:新生儿缺血缺氧性脑损伤(hypoxic-ischemic brain injury,HIBI)发病率为2.5/1000,相当于全球约400-900万婴儿,是由于子宫内胎儿窘迫、宫内感染、分娩期或分娩后胎儿窒息引起的围产期新生儿脑损伤。HIBI死亡率高,可引起长期神经系统后遗症,如认知障碍,行为障碍或记忆障碍等。目前对于HI引起的认知功能障碍、学习记忆能力降低临床上仍缺乏有效治疗措施。本研究从七氟醚后处理对新生大鼠缺血缺氧脑损伤的保护作用出发,为明确七氟醚后处理对新生大鼠缺血缺氧脑损伤的保护作用机制实现以下实验目的:1、缺血缺氧后24h新生大鼠海马区神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞数量变化,各类细胞24h自噬、溶酶体蛋白酶水平变化,及七氟醚后处理对其影响;2、七氟醚调节小胶质细胞溶酶体蛋白酶水平变化,影响海马区神经元死亡率与自噬的关系;3、七氟醚调节小胶质细胞自噬及溶酶体蛋白酶水平变化,改善远期预后与Ezh2/Pten/mTOR关系。明确七氟醚后处理的保护作用机制将为临床改善新生儿缺血缺氧性脑病的预后提供新靶点、新思路。研究方法:1、新生大鼠HIBI模型制备:对7日龄Sprague-Dawley(SD)大鼠行进左侧颈动脉结扎,清醒后放回母鼠笼中哺喂2h,接着在37℃缺氧箱中吸入8%O2,92%N2混合气体2h,制备HIBI模型。2、实验动物分组:按照随机数字表法进行随机分组。第一部分实验研究分为假手术组(sham组)、缺血缺氧组(HI组)、缺血缺氧七氟醚后处理组(HI+S组)共3组,每组14只实验动物(n=14);第二部分实验研究分为sham组、七氟醚后处理假手术组(sham+S组)、HI组、HI+S组、雷帕霉素组(HI+S+R组、HI+R组)共6组(n=36);第三部分实验研究分为sham组、sham+S组、HI组、HI+S组、Ezh2抑制剂组(HI+S+G组、HI+G组)共6组(n=36)。3、HI处理后24小时,测定死亡率、大鼠体重;Western Blot检测自噬相关蛋白LC3BII、Beclin1、P62/SQSTM、溶酶体蛋白酶CathepsinB、致炎细胞因子IL-1β、TNF-α及Ezh2表观调控Pten/Akt/mTOR表达;免疫荧光双染检测NeuN/LC3B,GFAP/LC3B,Iba1/LC3B,NeuN/cathepsin B,GFAP/cathepsin B,Iba1/cathepsin B表达。4、HI处理后7天,测定大鼠体重;取脑称重,测定左右脑质量比。5、HI处理后28天,测定大鼠体重;进行悬吊实验、水迷宫(Morris Water Maze,MWM)实验进行行为学分析;Nissl染色观察海马神经元存活情况,检测左右脑神经元密度比值。6、统计学分析:测量数据(体重、脑重、脑重比、神经元密度比、Western Blot检测蛋白表达水平、免疫荧光双染阳性细胞数百分比、悬吊时间、游泳速度、平台穿越次数、各象限停留时间),以均数加减标准差表示,使用单因素方差分析进行分析,然后进行Student-Newman-Keuls事后检验。逃避潜伏期采用双向重复单因素方差分析(处理组和时间作为重复因子),然后进行Bonferroni事后检验。各组死亡率采用Z检验进行分析。使用GraphPad Prism Version 6.0(GraphPad Software,USA)及SPSS21.0进行统计学分析。P<0.05被认为具有统计学意义。结果:1、在第一部分实验研究中:新生大鼠在HI处理后24h:海马区神经元、星形胶质细胞数量无显著变化(P>0.05);与sham组相比,HI组小胶质细胞数量显著增加(P<0.05),七氟醚后处理未显著改变HI引起的小胶质细胞数量增加(P>0.05);与sham组相比,海马区LC3BII表达明显增加,NeuN/LC3B双阳性细胞与NeuN阳性细胞比、GFAP/LC3B双阳性细胞与GFAP阳性细胞比、Iba1/LC3B双阳性细胞与Iba1阳性细胞比明显增高P<0.05,在HI+S组中,上述结果可被逆转(与HI组相比,P<0.05);在新生大HIBI模型中,溶酶体蛋白酶CathepsinB主要表达于小胶质细胞;与sham组相比,海马区cathepsinB表达明显增加,Iba1/cathepsinB双阳性细胞与Iba1阳性细胞比明显增高P<0.05,在HI+S组中上述结果可被逆转(与HI组相比,P<0.05)。2、在第二部分实验研究中:新生大鼠在HI处理后24h:Western Blot检测结果发现,与sham组相比,HI组海马区LC3BII、Beclin1、cathepsinB、IL-1β、TNF-α表达明显增加,同时P62/SQSTM表达明显减少P<0.05,在HI+S组中,上述结果可被逆转(与HI组相比,P<0.05);应用自噬激动剂雷帕霉素的后处理组LC3BII、Beclin1、cathepsinB、IL-1β、TNF-α表达上调,同时P62/SQSTM表达下调程度与HI+S组相比,明显增加P<0.05;与HI+S组相比,HI+S+R组海马区LC3B阳性细胞数量显著增多,P<0.05,Iba1/LC3B双阳性细胞与Iba1阳性细胞比、Iba1/cathepsinB双阳性细胞与Iba1阳性细胞比明显增高P<0.05。在HI处理后7天,与sham组相比,HI组大鼠左右脑质量比明显下降(P<0.05),在HI+S组中,左右脑质量比增加(与HI组相比,P<0.05),HI+S+R组左右脑质量比降低(与HI+S组相比,P<0.05)。在HI处理后35天,与sham组相比,Nissl染色结果HI组海马区神经元密度显著降低(P<0.05),在HI+S组中,海马区神经元密度降低程度被减弱(与HI组相比,P<0.05),HI+S+R组神经元密度降低(与HI+S组相比,P<0.05)。3、在第三部分实验研究中:新生大鼠在HI处理后24h:Western Blot检测结果发现,与sham组相比,HI组海马区Ezh2、H3K27me3/H3、pAkt/Akt、mTOR的表达显著减少P<0.05,Pten表达显著增多(P<0.05),在HI+S组中,上述结果可被逆转(与HI组相比,P<0.05),应用Ezh2抑制剂GSK126的七氟醚后处理组,H3K27me3/H3、pAkt/Akt、mTOR的表达显著减少(与HI+S组相比,P<0.05),Pten、LC3BII、cathepsinB表达显著增多(与HI+S组相比,P<0.05);与HI+S组相比,HI+S+G组海马区LC3B阳性细胞数量显著增多,P<0.05,Iba1/LC3B双阳性细胞与Iba1阳性细胞比、Iba1/cathepsinB双阳性细胞与Iba1阳性细胞比明显增高P<0.05。在HI处理后7天,HI+S+G组左右脑质量比降低(与HI+S组相比,P<0.05)。在HI处理后29-34天,MWM行为学检测结果,与sham组相比,HI组从第三天起平均逃避潜伏期明显延长(P<0.05),在HI+S组中,上述结果可被逆转(与HI组相比,P<0.05),应用GSK126后,平均逃避潜伏期延长(与HI+S组相比,P<0.05);Nissl染色结果检测显示,HI+S+G组海马区神经元密度明显降低(与HI+S组相比,P<0.05),行为学结果与脑损伤程度一致。结论:1、新生大鼠HI后24h,海马区神经元、星形胶质细胞数量无显著变化,小胶质细胞数量显著增加,各类细胞24h自噬水平升高,溶酶体蛋白酶CathepsinB主要表达于小胶质细胞,表达量增高,七氟醚后处理可抑制HI后自噬水平升高及CathepsinB增高。2、七氟醚后处理通过抑制自噬,调控小胶质细胞溶酶体蛋白酶CathepsinB表达水平,减轻海马区神经元死亡及缓解远期预后。3、七氟醚后处理通过Ezh2/Pten调控自噬水平、调节小胶质细胞极化,减轻远期神经元死亡,改善缺血缺氧新生大鼠脑损伤预后。
  • 【会议名称】:博士
  • 【类别名称】:赵平
  • 【载体】:中国医科大学
  • 【会议地点】:2019
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