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miR-199a-5p在七氟烷预处理大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的作用及机制的研究

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  • 【题名】:miR-199a-5p在七氟烷预处理大鼠脊髓缺血再灌注损伤中的作用及机制的研究
  • 【年份】:2019
  • 【作者】:鲍宁
  • 【关键词】:脊髓缺血/再灌注损伤  七氟烷预处理  miR-199a-5p  ECE1  凋亡
  • 【摘要】:背景:脊髓缺血/再灌注损伤(spinal cord ischemia reperfusion injury,SCIRI)是缺血脊髓组织恢复血液灌注后,脊髓组织的损伤更加严重,其特征是神经损害体征和形态学变化较前更加明显等。脊髓损伤包括原发性损伤和继发性损伤,SCIRI是在脊髓神经元缺血一段时间后,虽然血液再灌注没有表现出任何神经功能的改善,但出现了延迟性脊髓神经功能障碍,甚至瘫痪。当脊髓发生灌注损伤时,神经元的主要死亡方式是细胞凋亡,在大鼠脊髓短暂缺血后,缺血区域的神经元表现为神经元坏死,而周围的神经元表现为迟发性神经元死亡(Delayed neuronal death,DND)。已证明脊髓缺血/再灌注损伤引起的神经元坏死就是细胞凋亡。因此,抑制神经元细胞凋亡或减少迟发性神经元死亡已成为治疗脊髓损伤的重要课题。而目前大多数研究仍集中于蛋白、因子等水平,涉及到转录水平的分子机制还未明确,成为了SCIRI药物研发的巨大阻碍。因此,揭示SCIRI的病理分子机制迫在眉睫。Micro RNA(简称miRNA)是由18-24个核苷酸分子组成的短链非编码RNA分子,miRNA是一类功能强大的调节分子,作用于信使RNA(m RNA)3‘非翻译区的靶点,特异性沉默m RNA,在转录后水平调控基因的表达。miRNA存在于哺乳动物中枢神经系统(central nervous system,CNS)中脑、脊髓内,在中枢神经系统损伤、损伤修复以及变性疾病的病理生理进程中起到了重要的调节作用。吸入性麻醉药七氟烷具有麻醉,诱导苏醒迅速,血流动力学稳定等特点,广泛应用于临床。最近七氟烷预处理调控miRNA对于包括大脑、心,肺及肝等许多器官损伤具有保护作用,但七氟烷是否通过调控miRNA影响脊髓缺血/再灌注损伤却鲜有报道。目的:本研究旨在通过miRNA芯片技术,在大鼠脊髓缺血/再灌注损伤模型中以及七氟烷预处理大鼠脊髓/缺血再灌注损伤模型中,筛选差异表达的miRNA,然后进一步在大鼠体内验证,找出其调控的靶基因,深入探讨七氟烷预处理通过调节miRNA影响脊髓缺血/再灌注损伤的确切机制。研究方法:第一部分大鼠脊髓缺血/再灌注损伤以及七氟烷预处理后miRNA表达谱的筛选及验证1.建立大鼠脊髓/缺血再灌注损伤模型,阻断SD大鼠胸主动脉14min,18只大鼠随机分为三组(n=6):假手术组(Sham组)、模型组(I/R组)、七氟烷+模型组(SEVO+I/R组)。S组给予同样的手术,但不吸入七氟烷或行脊髓缺血/再灌注损伤;I/R组,开胸阻断胸主动脉14 min造成脊髓缺血/再灌注损伤;SEVO+I/R组,大鼠吸入2.0%的七氟烷3h后,行开胸阻断主动脉弓14 min造成脊髓缺血/再灌注损伤。缺血/再灌注24h,将大鼠断头取髓(L4-6)。2.将三组新鲜大鼠脊髓组织送上海吉凯基因化学技术有限公司进行微阵列芯片的miRNA表达谱分析,所得数据绘制热图,用MEV软件进行分析,选出差异最显著miRNA。3.验证芯片筛查结果,大鼠脊髓缺血/再灌注损伤后miR-199a-5p下降。3.1 q RT-PCR验证假手术组和模型组miRNA含量。3.2对假手术组和模型组进行TUNEL染色,进一步验证。4.选取大鼠脊髓缺血/再灌注损伤后0h,6h,12h,24h,48h,72h处死时间点,收集标本,q RT-PCR方法检测脊髓组织miR-199a-5p的含量,确定大鼠最适取材时间点。5验证芯片筛查结果,七氟烷预处理上调miR-199a-5p对脊髓缺血/再灌注损伤的保护作用。5.1实验动物分组:健康雄性SD大鼠,280-320g,18只,随机分为3组:假手术组(S组)、模型组(I/R组)、七氟烷+模型组(SEVO+I/R组)。5.2缺血/再灌注24h时用BBB评分法评价神经运动功能后将大鼠处死,取脊髓组织(L4-6)。5.3 TUNEL染色观察各组细胞凋亡情况。5.4伊文思蓝(EB)测定血-脊髓屏障(BSCB)通透性。5.5 q Real-time PCR检测各组脊髓组织miR-199a-5p含量。5.6 Western blot测定脊髓组织中Caspase-9和Bcl-2的蛋白水平。第二部分大鼠脊髓鞘内注射慢病毒,过表达或沉默miR-199a-5p,验证miR-199a-5p对脊髓缺血/再灌注损伤的保护作用1动物实验分组:健康雄性SD大鼠30只,随机分为五组(n=6),分别为:S组(sham)鞘内直接注射含有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的空病毒1×109,本组动物接受同样麻醉和手术准备,但不夹闭主动脉弓,不行缺血/再灌注损伤;I组(I/R)鞘内直接注射含有GFP的空病毒1×109,无创动脉夹于左颈总动脉和左锁骨下动脉之间的主动脉弓上夹闭14分钟后,撤除动脉夹;I/R+NC组(I/R+NC)鞘内直接注射含有GFP的无序质粒空病毒1×109;I/R+mimics组脊髓鞘内直接注射含有miR-199a-5p mimic的慢病毒(LV-5天后),无创动脉夹夹闭胸主动脉14分钟后,再灌注24h;I/R+inhabitor组(I/R+I)脊髓鞘内直接注射含有GFP miR-199a-5p inhabitor的慢病毒5天后,无创动脉夹夹闭胸主动脉14分钟后,再灌注24h。2组分别于再灌注0h,6h,12h,24h,48h,72h时点用Basso Beattie Bresnahan(BBB评分法)评价神经运动功能后将大鼠处死,取脊髓组织(L4-6),3 HE染色观察各组脊髓组织病理。4 TUNEL染色观察各组脊髓组织细胞凋亡情况。5伊文思蓝(EB)测定血-脊髓屏障(BSCB)通透性。6 q Real-time PCR检测各组脊髓组织miR-199a-5p含量。7行免疫荧光组织化学单标染色,明确miR-199a-5p在神经元细胞表达情况。8 Western blot测定脊髓组织中Caspase-9,Bcl-2,JNK,p-JNK,ERK,p-ERK的蛋白水平。第三部分miR-199a-5p靶向下调ECE1,保护大鼠脊髓缺血/再灌注损伤1生物信息学软件预测miR-199a-5p的靶基因,并构建双荧光素酶报告基因载体及验证miR-199a-5p与ECE1靶向关系。1.1通过micro RNA靶基因预测软件microrna.org/microrna和Targetscane.org预测靶基因,并q RT-PCR验证。1.2通过micro RNA靶基因预测软件Targetscan获取miR-199a-5p与ECE1基因3‘-UTR潜在的互补结合位点。1.3 PCR技术扩增ECE1基因3‘端非翻译区,将此序列与miR-199a-5p mimics或空质粒(NC)共转染到pmir GLO-ECE1-野生型(WT)的293细胞里;将此序列突变序列与miR-199a-5p mimics或NC共转染到pmir GLO-ECE1-突变型(MUT)的293细胞里,共四组,检测四组细胞中荧光素酶活性。2慢病毒介导的ECE1-sh RNA在大鼠体内沉默靶基因ECE1,验证miR-199a-5p通过下调ECE1保护脊髓缺血/再灌注损伤。2.1 sh RNA干扰ECE1有效靶点筛选2.2实验动物分组:健康雄性SD大鼠24只,随机分为四组:Sham组:(S)鞘内直接注射含有GFP的空病毒1×109,本组动物接受同样麻醉和手术准备,但不夹闭主动脉弓,不行脊髓缺血/再灌注损伤;I组:(I/R)鞘内直接注射含有GFP的空病毒1×109,无创动脉夹于左颈总动脉和左锁骨下动脉之间的主动脉弓上夹闭14分钟后再开放,造成脊髓缺血/再灌注损伤;NC组(I/R+NC):鞘内直接注射含有GFP带无序质粒的空病毒;sh RNA-ECE1组:鞘内注射含有慢病毒LV-sh RNA-ECE1沉默ECE1。2.3各组分别于再灌注0h,6h,12h,24h,48h,72h时点用BBB评分法评价神经运动功能后将大鼠处死,取脊髓组织(L4-6),2.4 HE染色观察脊髓组织病理情况;TUNEL染色观察各组细胞凋亡情况,伊文思蓝(EB)测定血-脊髓屏障(BSCB)通透性,2.5 q Real-time PCR检测各组ECE1含量,2.6 Western blot测定脊髓组织中ECE1,Caspase-9,Bcl-2,JNK,p-JNK,ERK,p-ERK的蛋白水平。结果:第一部分:大鼠脊髓缺血/再灌注损伤以及七氟烷预处理后miRNA表达谱的筛选及验证1缺血/再灌注损伤24h,采用芯片分析miRNA表达谱的改变,与假手术组相比,在17种miRNA在脊髓缺血再灌注损伤24h有改变,其中5种上调,12种下调;七氟烷预处理后,与I/R组比,七氟烷预处理组有8种miRNA上调,9种miRNA下调。其中miR-199a-5p I/R组比sham组Fold Change为0.431小于0.5;七氟烷预处理比模型组Fold Change为2.39,大于2.0。七氟烷预处理后可明显逆转脊髓缺血/再灌注损伤的miRNA为miR-199a-5p。2.1 q RT-PCR验证,与Sham组比,I/R组miR-199a-5p明显降低。2.2 TUNEL染色,脊髓/缺血再灌注后,神经元胞核较大,部分细胞可见核固缩深染,位于细胞的一侧;与S组相比,I/R组的调亡率显著增加。3 q RT-PCR方法检测大鼠I/R组各时间点脊髓miR-199a-5p的含量,24h时点miR-199a-5p表达量最低,所以选取24h时点做为处死大鼠,留取标本时间点。4验证七氟烷预处理后miR-199a-5p上调4.1与S组比较,I/R组神经运动功能评分降低,HE染色脊髓组织结构紊乱,细胞核不规则,七氟烷预处理改善了神经功能评分,改善了病理组织学变化。4.2 TUNEL染色显示脊髓缺血/再灌注损伤后细胞凋亡率增加,七氟烷预处理后,减少了细胞凋亡的数量。4.3脊髓缺血/再灌注损伤后BSCB通透性增加,七氟烷预处理减少BSCB通透性,显著减少伊文思蓝外渗。4.4 Western blot显示七氟烷预处理后,与脊髓缺血/再灌注损伤比较,Bcl-2明显升高,Caspase-9蛋白显著降低。第二部分大鼠鞘内注射慢病毒,过表达或沉默miR-199a-5p,验证miR-199a-5p对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用1与sham组相比,各组大鼠在6h,12h,24h,48h,I/R组大鼠BBB评分均降低,转染LV-miR-199a-5p mimics或LV-miR-199a-5p inhibitor后,可以增高或降低大鼠神经功能评分。2 HE染色检测大鼠脊髓组织损伤病理情况,I/R组可见核碎裂,转染LV-miR-199a-5p mimics脊髓组织损伤明显减轻,而转染LV-miR-199a-5p inhibitor后,脊髓组织损伤更加严重。3 TUNEL染色结果显示,与Sham组相比,I/R组凋亡神经元数目明显增加;与I/R组相比,转染LV-miR-199a-5p mimics后,可见凋亡细胞数显著减少,转染LV-miR-199a-5p inhibitor后,凋亡细胞明显增加。4伊文思蓝染色测定脊髓组织BSCB完整性,I/R组在24h伊文思蓝外渗到脊髓实质,破坏了血-脊屏障;转染LV-miR-199a-5p mimics后,显著减少了伊文思蓝的外渗,转染LV-miR-199a-5p inhibitor后,伊文思蓝外渗明显增加。5 q Real–time PCR检测脊髓组织中miR-199a-5p的表达。与Sham组相比,I/R组和I/R+NC组miR-199a-5p表达明显减少;与I/R组相比,I/R+M组miR-199a-5p表达水平明显增加;而I/R+I组miR-199a-5p表达水平明显减少,表明向大鼠体内慢病毒转染成功。6与Sham组比较,I/R组和I/R+NC组荧光强度(红色)明显增强,神经元细胞密度明显增加;与I/R+NC组比较,I/R+M组荧光强度(红色)明显增强,神经元细胞密度明显增加,而I/R+I组荧光强度(红色)明显减弱,神经元细胞密度明显减少。7 Western blot检测显示脊髓组织中Caspase-9,Bcl-2,JNK,p-JNK,ERK,p-ERK蛋白的表达参与了神经细胞凋亡,与Sham组相比,缺血/再灌注24h时I/R组和I/R+NC组Bcl-2降低,Caspase-9、p-JNK、p-ERK显著升高。与I/R组相比,I/R+M组Bcl-2升高,Caspase-9、p-JNK、p-ERK蛋白明显降低;I/R+I组Bcl-2降低,Caspase-9、p-JNK、p-ERK蛋白表达显著升高。第三部分验证miR-199a-5p靶向调控ECE1,保护大鼠脊髓缺血/再灌注损伤1 miR-199a-5p与野生型ECE1存在结合位点,miR-199a-5p对野生型ECE1重组质粒荧光活性有明显的抑制作用,证实miR-199a-5p能够靶向调控ECE1基因。1.1软件预测后q Real-time PCR验证,确定ECE1为miR-199a-5p的靶基因。1.2成功构建双荧光素酶报告基因重组质粒pmir GLO-ECE1-WT和pmir GLO-ECE1-MUT。miR-199a-5p与野生型ECE1存在结合位点,miR-199a-5p对野生型ECE1重组质粒荧光活性有明显的抑制作用,证实miR-199a-5p能够靶向调控ECE1基因。2慢病毒介导的ECE1-sh RNA可以下调大鼠脊髓组织ECE1蛋白的表达2.1 q Real-time PCR检测sh RNA-ECE1组ECE1含量明显降低2.2与I/R组相比,ECE1被沉默后,各组大鼠在6h、12h、24h、48h、72h大鼠下肢运动功能BBB评分明显升高。2.3与I/R组相比,ECE1-sh RNA组HE染色改善了组织病理学改变,使其接近正常组织;TUNEL染色现实凋亡细胞数量明显减少;伊文思蓝染色显示伊文思蓝外渗减少,BSCB通透性减小。2.4与I/R组相比,ECE1-sh RNA组Bcl-2升高,p-JNK,p-ERK蛋白表达降低,ECE1蛋白表达明显降低。结论:1通过miRNA芯片分析,选取差异表达显著miR-199a-5p,在脊髓缺血/再灌注损伤中研究其作用机制。2七氟烷预处理可以保护脊髓缺血/再灌注损伤,其机制可能与其上调miR-199a-5p有关。3 miR-199a-5p丰富表达于神经元细胞,过表达miR-199a-5p可以改善大鼠脊髓组织细胞凋亡,抑制miR-199a-5p表达可以促进细胞凋亡。4 ECE1是miR-199a-5p的靶基因,miR-199a-5p通过下调ECE1,减少大鼠脊髓细胞凋亡,保护脊髓缺血/再灌注损伤。
  • 【会议名称】:博士
  • 【类别名称】:马虹
  • 【载体】:中国医科大学
  • 【会议地点】:2019
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