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适用于多种荧光标记样本的塑性包埋方法

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  • 【题名】:适用于多种荧光标记样本的塑性包埋方法
  • 【年份】:2019
  • 【作者】:任淼
  • 【关键词】:全脑塑性包埋  多色标记  精细结构  红色荧光蛋白  化学荧光染料/探针  荧光信号保持  背景荧光抑制
  • 【摘要】:神经环路精细结构的解析对理解大脑功能至关重要。荧光显微光学切片断层成像(f MOST)技术是获取高分辨全脑三维数据集的代表性技术之一,发展兼顾多种精细结构信息同时保持和良好切削与成像性能的全脑塑性包埋方法对该技术的发展具有重要意义。本文围绕全脑样本制备中存在的组织形态保持差、微米厚度连续切削不稳定以及对红色荧光蛋白和化学荧光染料/探针荧光保持率低等关键技术问题展开研究。以解决多色荧光标记神经环路中多种精细结构同时获取存在的问题为导向,完成了以下工作内容:(1)建立了适用于批量制备并且具有低背景荧光的稳定包埋策略GMA-S。本文通过优化灌注参数,减少了解剖固定环节对形态结构的影响;其次,通过调整树脂配方,优化了包埋后样本的硬度和疏水性,提高了树脂包埋样本微米厚度切削性能;并探究了核酸染料在树脂包埋样本上的渗透效率,得到了适用于树脂包埋样本成像时同时获得细胞构筑信息的核酸染料类型及浓度,建立了GMA-S包埋方法,能够保持GFP标记的精细结构信息,并可用于批量样本稳定制备。GMA-S方法能够使样本保持良好形态、同时具备较低的背景荧光和长时间稳定的微米厚度切削性能。将该包埋方法与f MOST相结合,获取了具有细胞构筑信息的胆碱能神经元和皮层锥体神经元的高分辨率全脑数据集,进而分析了胆碱能神经元在全脑三维空间中的分布规律及运动核团胆碱能神经元、皮层锥体神经元的投射模式。(2)建立了适用于多色荧光蛋白的包埋策略GMA-D。本文研究发现,有机试剂和聚合温度是影响获取RFP标记样本精细结构的主要因素。通过在脱水剂和树脂渗透液中添加荧光保护剂提高RFP保持率,同时通过更换引发剂降低聚合温度提高了红色荧光图像的信噪比。结合以上两点,建立了GMA-D包埋方法。该方法将RFP的保持率提升了近一倍,并对GFP和BFP也具有高保持率,能够保持多种荧光蛋白标记的精细结构。将该包埋方法与f MOST相结合,获得了RFP标记的血管活性肠肽阳性(VIP)神经元全脑数据集,进而重建了皮层VIP神经元形态并分析了其分布规律与形态特性。此外,还基于红绿双色荧光蛋白标记样本,在单个鼠脑上同时获取了脑桥胆碱能神经元的全脑输出/输入数据集,发现胆碱能神经元会接收来自其他脑区的胆碱能神经元的投射调控。(3)建立了适用于荧光染料/探针的包埋策略GMA-T。本文研究发现,塑性包埋中背景荧光原来的抑制措施对染料/探针荧光亮度的保持具有较大影响。通过将新型背景抑制剂(TB)与全脑塑性包埋相结合,并优化TB的使用浓度,建立了适用于荧光染料/探针的全脑塑性包埋方法(GMA-T)。该方法对Dy Light、Alexa和CTB等荧光染料/探针具有较高保持率,同时对常用的荧光蛋白也具有较高的荧光保持率。利用该方法,初步获取了包括神经元、血管和细胞构筑在内的多种神经系统的精细结构信息。本课题面向多色荧光标记的样本,建立并优化了多种全脑塑性包埋方法,使其满足多种精细结构同时获取的需求,验证了这些方法对神经环路精细结构成像质量的改善效果。本文建立的全脑塑性包埋策略结合f MOST成像,将成为单细胞水平研究神经环路和神经元形态特征的有利工具。
  • 【会议名称】:博士
  • 【类别名称】:龚辉
  • 【载体】:华中科技大学
  • 【会议地点】:2019
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