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基于PXR-CYP3A通路对附子不同提取方式下毒性及机制的研究

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  • 【题名】:基于PXR-CYP3A通路对附子不同提取方式下毒性及机制的研究
  • 【年度】:2019
  • 【作者】:黄光耀
  • 【关键词】:附子  PXR  CYP3A4  药物相互作用  毒性  PI3K/Akt/mTOR
  • 【摘要】:背景:乌头(Aconitum carmichaeli Debx)的次生根称为“附子”,盛产于四川省江油市等地。中医认为,附子具有回阳救逆、补火助阳、逐风寒湿邪功效,是“回阳救逆的第一品药”。现代科学研究发现,附子提取物有一定的心脏毒性,亦有大量报告称因生食或误食附子而中毒的临床案例。常通过发泡、漂白、蒸煮和加工来降低附子的毒性。所以我们从代谢酶、毒性大小及其可能作用机制层面对不同提取方式下的附子进行探究。目的:本实验是基于PXR-CYP3A通路对附子不同提取方式下毒性的研究,并对探讨附子的毒性机制。本实验分为三个部分,第一部分是探究附子的不同提取物对细胞色素P450(CYP450)的关系;第二部分基于代谢酶基础上探究附子提取物的毒性大小;第三部分基于代谢组学的方法探究附子提取物对于大鼠的心脏毒性及其机制。方法:本研究中附子的提取方式为传统的水煎煮和使用80%乙醇的醇沉方式两种。采用超高效液相色谱/飞行时间-质谱UPLC-Q/TOF-MS的方式检测了提取物中的物质成分,并定量检测其中三种双酯型生物碱。将附子提取物作用于HepG2细胞,采用实时Real-time PCR(RT-qPCR)、Western blot分析和报告基因法检测给予不同附子提取物后的HepG2细胞中PXR和CYP3A4基因和蛋白的表达情况。使用RT-qPCR和报告基因法检测双酯型生物碱在细胞中对PXR和CYP3A4的影响。并用报告基因法检测单酯型生物碱在细胞中的PXR和CYP3A4的表达情况。接着对3组大鼠采用灌胃的方式给予水提物、醇提物或蒸馏水7天。7天后,提取大鼠肝脏中的蛋白,检测其中PXR、CYP3A4和caspase-3的蛋白表达量。将附子提取物作用于HepG2和稳定转染PXR-CYP3A4质粒的HepG2细胞,使用MTS法检测其对细胞的毒性作用。再对附子提取物处理过的两种细胞中的蛋白进行提取,并检测其中caspase-3的蛋白表达量。用HE染色方法对心脏组织进行染色。采用ELISA法测定大鼠血清中肌钙蛋白(CTnI)、肌酸激酶同工酶MB(CKMB)和儿茶酚胺的含量。用比色法测定血清乳酸脱氢酶(LDH)。用代谢组学方法检测大鼠体内小分子物的代谢变化。用Western blot法检测磷酸肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)、转化生长因子-β1(TGF-β1)和caspase-3的表达含量,免疫组织化学检测CTnI、mTOR和TGF-β1的蛋白表达。结果:两种附子提取物中含有较多的生物碱,且均含有双酯型生物碱和单酯型生物碱。两种附子提取物和三种双酯型生物碱均可诱导PXR的激活并且可介导CYP3A4的表达,但在剂量依赖性上存在个体差异。在诱导PXR和CYP3A4高表达的过程中,附子的醇提液、中乌头碱和次乌头碱均与剂量呈正相关性。结果也显示单酯型生物碱均能显著抑制PXR和CYP3A4的表达。在大鼠中,附子提取物能诱导大鼠肝脏中的PXR、CYP3A4和caspase-3蛋白的高表达,且附子醇提组高于水提组。两种附子提取物对两种细胞均具有毒性作用,其中对稳转PXR-CYP3A4质粒的HepG2细胞的毒性作用要高于普通的HepG2细胞。相对于对照组而言,两种细胞中的蛋白检测结果显示,两组附子提取物组的caspase-3表达量上升。其中心脏指数、病理切片、染色结果表明和心脏损伤标志物的结果显示,不同的附子提取物对大鼠的心脏毒性大小不同,醇提物的毒性高于水提物。不同组大鼠体内的小分子代谢产物有显著差异,根据小分子代谢物的差异分析,并结合通路分析可得附子提取物对大鼠心脏毒性的可能机制,并在分子水平上进行验证。结果发现两种附子提取物能激活大鼠心肌细胞PI3K、p-AKT、mTOR、p-mTOR、TGF-β1和caspase-3蛋白表达。结论:由于提取物中双酯型和单酯型生物碱的含量不同,并且不同生物碱对PXR和CYP3A4的作用效果和程度也不同,故附子两种提取物对PXR和CYP3A4的激活的差异可能与附子提取液中不同的物质成分之间的药物与药物的相互作用造成的。且在大鼠实验中发现,附子提取物具有毒性,并且醇提物激活代谢酶程度较高,且毒性作用也越大。提示可能是附子通过PXR药物转运蛋白使附子中毒性物质进入血液循环之后而产生的毒性。结果也显示出附子提取物的心脏毒性。且附子的水提物和醇提物通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导心肌细胞凋亡而产生心脏毒性。后续可探究使用不同提取方式和不同浓度的附子提取物,检测药物代谢动力学,主要关注血清中有毒生物碱的血药浓度,观察毒性反应。并对肝脏中的PXR和CYP3A4的激活效应进行检测,探寻与发现其中的内在联系,更好的指导附子的临床使用。
  • 【分类号】:R285.5
  • 【学位名称】:硕士
  • 【导师名称】:高杉
  • 【学位授予单位】:安徽医科大学
  • 【学位年度】:2019
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