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体内外微环境对大鼠脂肪来源干细胞干性维持的影响及机制研究

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  • 【题名】:体内外微环境对大鼠脂肪来源干细胞干性维持的影响及机制研究
  • 【年度】:2019
  • 【作者】:汪超
  • 【关键词】:脂肪来源干细胞  胰岛素样生长因子2  增殖  分化  干细胞治疗
  • 【摘要】:背景:脂肪来源干细胞(Adipose-derived stromal cells,ADSCs)是应用于组织工程和细胞治疗的一类重要的间充质干细胞(Mesenchymal stromal cells,MSCs)。然而,伴随体外扩增培养所致ADSCs干性维持降低是限制其应用的主要瓶颈之一,失去体内微环境则是导致该瓶颈的关键因素。相关研究提示组织微环境内的一种或多种分泌因子可有效调控ADSCs的生物学特性。其中有研究发现微环境中持续高表达的胰岛素样生长因子2(Insulin-like growth factor 2,IGF2)可能参与调控多种干细胞的干性,但是目前尚不清楚该因子是否对ADSCs的生物学特征产生影响。进一步,为了更全面的阐述微环境对ADSCs的影响,许多研究者着力于构建不同程度模拟体内微环境的培养模型,并证实这些模型有利于在体外维持ADSCs的干性。然而这些研究并不能反映真实的组织微环境。因此如何更好的模拟体内微环境从而维持ADSCs的干性是亟待解决的关键问题。目的:探讨IGF2对大鼠ADSCs干性维持的作用及机制;构建原位组织内干细胞培养模型,明确体内微环境对ADSCs干性维持的影响及机制。方法:第一部分:分离、培养大鼠ADSCs并鉴定。第二部分:(1)qRT-PCR和Western blot检测不同年龄大鼠脂肪组织中IGF2的表达。(2)MTT和Western blot分别检测不同浓度IGF2对ADSCs增殖和干性分子NANOG,OCT4和SOX2的表达。(3)添加特异性IGF-1R/IR抑制剂BMS-754807和IGF-1R抑制剂Picropodophyllin(PPP),检测IGF2对ADSCs增殖、干性相关分子表达、成脂和成骨分化的影响。第三部分:(1)通过向裸鼠双侧腹股沟脂肪组织内注射体外第4代大鼠GFP-ADSCs的方法构建原位干细胞培养模型。在注射后第3、5和7天收集体内培养GFP-ADSCs,并收集同时期常规体外培养的细胞。根据培养模式不同,将GFP-ADSCs分为三组:体内组、体外组和对照组(第4代ADSCs),并进行干性相关指标的检测。(2)采用MTT、CFU-F和qRT-PCR法检测ADSCs的增殖能力;qRT-PCR、Western blot和IF法检测干性分子的表达;利用特异性染色和qRT-PCR分析ADSCs的成脂、成骨和成软骨分化能力。(3)RNA-seq技术检测三组ADSCs的mRNA表达,并对差异表达基因进行GO以及Pathway富集分析,采用qRT-PCR验证测序结果。结果:第一部分:分离培养的低代数ADSCs具有MSCs的形态特征和三向分化能力,同时高表达CD90和CD29,并很少表达CD34和CD45。第二部分:(1)大鼠脂肪组织中IGF2的表达在出生10天后呈降低趋势。(2)在1%血清条件下,加入外源性100 ng/mL IGF2可促进ADSCs增殖和干性分子的表达,该作用可被BMS-754807阻断,而PPP仅抑制其促干性分子表达的作用。(3)加入100 ng/mL IGF2可提高ADSCs成脂和成骨分化,该作用可被BMS-754807中和,而PPP仅抵消其促成脂分化作用。第三部分:(1)随着体内培养时间延长,ADSCs的数量逐渐减少。从形态学来看,体内培养的ADSCs呈现三维生长方式,具有多个伪足,在体外贴壁培养24小时后细胞呈长梭型,具有强折光度。而体外组ADSCs多数表现为宽而平的形态,其折光度降低。(2)体内培养至第3、5和7天,MTT提示ADSCs的增殖较体外组显著上调,衰老相关标记P15和P21表达降低,而CFU-F能力仅在第5和7天高于体外组。(3)体内培养ADSCs至第3天,干性相关分子的表达较体外组无差异,而第5和7天,其表达显著上调。(4)相较于体外组,体内组ADSCs在第3天,其成软骨分化能力显著上调;于第5天,成骨分化上调;于第7天,成脂分化上调。(5)RNA-seq结果提示,体内与体外组ADSCs之间有1308个差异表达基因;体外组与对照组有419个差异表达基因。GO和KEGG富集分析提示差异表达基因主要定位于细胞外基质和细胞外间隙,参与调节细胞增殖和细胞外基质合成等。这其中,干细胞多能性调控、Jak-STAT、Notch等通路可能参与维持ADSCs的干性(P<0.05)。结论:大鼠脂肪组织中IGF2的表达在出生10后天呈降低趋势,而外源性IGF2可通过IGF-1R和IR维持8周龄大鼠ADSCs的干性,提示脂肪组织微环境中IGF2可能参与调控ADSCs的干性维持过程。另一方面,原位脂肪组织内培养有利于维持ADSCs增殖及多能性,这一过程受多种基因的协同调控,其中干细胞多能性调控、Jak-STAT和Notch等通路可能参与调控。
  • 【分类号】:R329.2
  • 【学位名称】:博士
  • 【导师名称】:许峰,张波
  • 【学位授予单位】:重庆医科大学
  • 【学位年度】:2019
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