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CYP24A1基因单核苷酸多态性对女性肺癌发生及预后的作用及相关机制研究

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  • 【题名】:CYP24A1基因单核苷酸多态性对女性肺癌发生及预后的作用及相关机制研究
  • 【年度】:2019
  • 【作者】:屈若祎
  • 【关键词】:非吸烟女性  CYP24A1  单核苷酸多态性  A549细胞系  1,25(OH)2D3  凋亡  增殖
  • 【摘要】:目的:在世界范围内,恶性肿瘤是目前导致居民死亡的主要死因。其中,肺癌的发病率和死亡率均排在恶性肿瘤的首位,对人类的健康和寿命造成了极大的威胁。在肺癌病例中,吸烟目前被认为是导致肺癌发生和发展的的危险因素。肺癌的发生和发展是遗传因素和环境因素共同作用的结果,尽管吸烟被认为是影响肺癌发生最主要的危险因素,但据报道,仍有15%的男性肺癌患者和53%的女性肺癌患者的发病并不是由吸烟引起的。遗传因素在肺癌的发生发展中已经引起了越来越多科学研究者的关注和探讨。但其确切的机制仍然无法被完全阐明。因此,对影响肺癌发生发展的遗传学机制进行更深入的探索,以期提高肺癌发病风险的预测和防治水平,显得更加重要。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)是存在于人类基因组中最广泛的一类变异,指的是基因组DNA中单个位点的核苷酸的替换。并且其最小等位基因的出现频率大于或等于1%。根据SNPs存在于基因组的不同功能区域,他们在不同的细胞生物学过程中的功能对人体可能产生一定影响。1,25(OH)2D3是维生素D3在人体中的活化表现形式。除了在调节钙稳态和骨盐沉积之外,还在人体细胞的增殖和分化的过程中起到了重要的作用。有研究表明,在非小细胞肺癌中,上皮细胞的间质化与机体对维生素D的敏感性相关。而一定剂量的1,25(OH)2D3,在一些肿瘤细胞中展现了分化诱导和抗恶性肿瘤细胞增生的作用。25-羟维生素D3-24-羟基化酶(25-Hydroxyvitamin D3 24-hydroxylase,CYP24A1)是细胞色素P450酶家族的成员,CYP24A1的表达是一个1,25(OH)2D3依赖的过程。其主要的功能是将1,25(OH)2D3代谢,使其钝化。是维持维生素D3稳态的关键酶。有研究表明,在人正常肺支气管上皮细胞中,有低表达量的CYP24A1存在。1,25(OH)2D3可以诱导CYP24A1的表达,通过降解活化的维生素D3使其在细胞中保持稳态。这种调节机制表明,维生素D3的代谢在肺部代谢中担当着重要的角色。现有的研究证据表明,在人类乳腺癌、前列腺癌和肺癌等肿瘤细胞中均发现了CYP24A1的异常过量表达。部分肿瘤的发生和预后状况与血清中维生素D3水平和CYP24A1 mRNA的表达量水平有着密切的关系。还有研究显示,CYP24A1基因上的单核苷酸多态性可以影响1,25(OH)2D3在前列腺癌中的活性。有的研究指出,CYP24A1是1,25(OH)2D3在非小细胞肺癌中的潜在的生物学标志物且其表达受其基因上单核苷酸多态性的影响。通过对CYP24A1异常高表达的研究和对活性维生素D3与肿瘤生物学行为影响的研究,很可能阐明高表达CYP24A1对肿瘤细胞的影响,从而发挥1,25(OH)2D3的抗肿瘤效力,提高肿瘤患者的生存时间。随着越来越多的CYP24A1上的单核苷酸多态性位点被发现,这些位点与肿瘤发病风险的相关性也引起了关注。但由于其代谢1,25(OH)2D3的功能,更多的研究关注于前列腺癌,乳腺癌等激素相关性的肿瘤。与肺癌相关的易感性分析相对较少。针对CYP24A1基因上的SNPs对肺癌功能学影响的探究也相对较少。因此,为了明确CYP24A1的单核苷酸多态性与肺癌的关系,我们在非吸烟女性人群中进行了CYP24A1上单核苷酸多态性位点与肺癌易感性及生存时间的研究。接着,进了1,25(OH)2D3对肺癌生物学行为的影响和CYP24A1 mRNA表达量的影响的探究,探究了1,25(OH)2D3条件下,靶研究位点可能对肺癌生物学行为产生的影响。并对CYP24A1上存在的与癌症发病风险相关的位点进行了meta分析。研究方法:第一部分研究,首先对CYP24A1上癌症相关的单核苷酸多态性位点进行查找。研究选取了文献中报道的CYP24A1上与癌症相关的多态性位点。然后我们应用Haploview寻找了与报道相关的连锁不平衡位点。应用SNPinfo对存在影响基因功能的单核苷酸多态性位点进行预测,接着应用RegulomeDB网站对筛选出的可能存在功能影响的位点进行评分。将选取的位点作为分析CYP24A1单核苷酸多态性与非吸烟女性肺癌易感性关系的位点进行探究。搜集观察对象的信息,应用Taqman法对生物样本进行基因分型,并进行分层分析和基因-环境交互作用分析。接着对收集的患者病例进行定期随访,以肺癌死亡作为结局事件开展了预后研究,以期发现CYP24A1基因上的多态性位点可能与非吸烟女性肺癌之间存在的影响患者生存时间的关系。第二部分研究使用用TCGA数据库测序数据和GEO数据库的组织芯片数据,应用GEPIA在线分析平台探究CYP24A1 mRNA在肺腺癌组织、肺鳞癌以及正常肺组织中的表达情况。接着,对不同类型肺癌细胞系中CYP24A1 mRNA表达量的影响进行了探究。分别配置含有高、中、低浓度1,25(OH)2D3的细胞培养液。将培养液分别加入A549肺腺癌细胞系,LK-2肺鳞癌细胞系进行细胞培养。于培养24h、48h观察细胞形态,酶标仪检测量吸光度,并收集细胞,进行CYP24A1mRNA含量的测定。观察1,25(OH)2D3对不同种类肺癌细胞系的抗增殖作用以及对CYP24A1 mRNA表达量的影响。接着向A549肺腺癌细胞系中瞬时转入野生型(C等位基因)和突变型(T等位基因)质粒。在1,25(OH)2D3条件下培养,并利用CCK-8实验检测细胞增殖的改变情况。利用7-AAD和Annexin V-APC染料将细胞染上荧光染料,应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。将细胞固定后,利用PI染料将细胞中的DNA染上荧光染料,应用流式细胞仪检测细胞周期情况,从而判断不同基因型rs6068816位点对肺癌生物学行为的影响。第三部分研究应用PubMed、Web of Science、Embase、CNKI、万方数据库以及参考文献列表索引等在线数据库资源,对CYP24A1基因上的单核苷酸多态性位点进了meta分析。设计检索式并建立纳入和排除标准,对相关文献进行检索。并对筛选得到的文献进行异质性检验,发表偏倚检验以及敏感性分析。同时,加入本研究第一部分的数据,扩大样本量,以期进一步发现CYP24A1基因上单核苷酸多态性位点与癌症发病风险之间的关系。本研究所用统计假设检验均采用双侧检验,认为P<0.05是具有统计学差异的标准。统计分析均采用SPSS统计软件和STATA软件进行。采用Logistic回归计算比值比及其95%置信区间来评价不同基因型与非小细胞肺癌发病风险之间的关系。两组连续型变量应用t检验进行分析,多组连续型变量应用方差分析进行比较,分类变量间的比较应用卡方检验进行比较,两连续型变量间相关性应用Pearson相关进行计算。使用Kaplan-Meier法制作生存曲线。使用log-rank检验不同生存曲线间的差异。采用Cox回归模型计算风险比及95%置信区间。结果:1.由生物信息学分析得到的结果发现,位于CYP24A1编码区的rs6068816位点可能影响基因的功能,且功能评分最高,故选取rs6068816位点作为研究的靶点。通过Taqman基因分型得到的结果发现,rs6068816位点上的T等位基因与降低非吸烟女性肺癌的发病风险相关,在肺腺癌和中晚期肺癌中,该位点的T等位基因也与降低非吸烟女性肺癌的发病风险相关,差异具有统计学意义。另外还发现在有油烟暴露的情况下,rs6068816位点上的T等位基因同样是一个保护因素。病理类型、临床分期和是否化疗对非吸烟女性肺癌患者的生存期存在影响。但rs6068816位点与非吸烟女性肺癌患者的生存时间无相关性。2.GEPIA平台的分析结果显示,在人体组织中,肺腺癌和肺鳞癌的CYP24A1mRNA表达量均高于正常肺组织,且肺腺癌组织中的CYP24A1 mRNA表达量要高于肺鳞癌组织。分别将A549肺腺癌细胞系和LK-2肺鳞癌细胞系在含有高、中、低浓度的1,25(OH)2D3培养液中培养24h、48h后,A549细胞系和LK-2细胞系中的CYP24A1 mRNA的表达量随着1,25(OH)2D3浓度的增加而增加。与阴性对照组相比,中、高浓度组中A549和LK-2细胞系中CYP24A1 mRNA表达量都显著增高。随着1,25(OH)2D3浓度的增加,A549和LK-2细胞系的增殖受到抑制。与阴性对照组相比,中、高浓度组中LK-2细胞系的吸光度降低明显,而A549细胞系的吸光度下降并不明显。与野生型相比,rs6068816突变型更能够抑制A549细胞增殖能力,细胞凋亡受到促进,凋亡细胞所占比例增加。经过1,25(OH)2D3处理的野生型组和突变型组,与未经1,25(OH)2D3处理的对照组相比,也都出现了抑制A549肺腺癌细胞系的增殖,促进A549肺腺癌细胞系凋亡的结果。3.通过meta分析的结果可知,rs6068816位点突变纯合TT基因型与降低整体癌症的发病风险相关。rs4809957位点的突变杂合AG基因型与升高总体癌症的发病风险相关。rs2296241位点的突变纯合GG基因型在高加索人群中,与升高总体癌症的发病风险相关。同时,等位基因分析的结果也提示,rs2296241位点上的G等位基因与更高的高加索人群总体患癌风险相关。按癌症种类分层后,本研究发现rs2296241位点的突变纯合GG基因型与提高整体人群的前列腺癌发病风险有关。且等位基因分析也提示G等位基因与总人群更高的前列腺癌发病风险有关。本研究纳入的文献并未发现rs2762939各模型与癌症发病风险之间的关系。本研究经检验后并未发现发表偏倚。结论:CYP24A1-rs6068816位点与非吸烟女性肺癌的发病风险相关。rs6068816位点与非吸烟女性肺癌患者的预后生存时间无关。1,25(OH)2D3可以抑制LK-2细胞系和A549细胞系的增殖。1,25(OH)2D3能够促进A549细胞系的凋亡。在1,25(OH)2D3条件下,A549肺腺癌细胞系中,rs6068816位点的突变型相较野生型,更能促进肺腺癌细胞系的凋亡和抑制肺腺癌细胞系的增殖作用。CYP24A1-rs6068816,CYP24A1-rs4809957,CYP24A1-rs2296241与癌症的发病风险相关。
  • 【分类号】:R734.2
  • 【学位名称】:博士
  • 【导师名称】:周宝森
  • 【学位授予单位】:中国医科大学
  • 【学位年度】:2019
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