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LncRNA408调控乳腺癌干细胞(BCSC)富集与干性维持的作用及分子机制研究

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  • 【题名】:LncRNA408调控乳腺癌干细胞(BCSC)富集与干性维持的作用及分子机制研究
  • 【年度】:2019
  • 【作者】:文思阳
  • 【关键词】:乳腺癌  肿瘤干细胞  LncRNA  CBY1  β-catenin
  • 【摘要】:目的:探究Lnc RNA408调控乳腺癌干细胞(BCSC)富集与干性维持的作用及分子机制。方法:(1)利用生物信息学分析EMT转变后干性相关的lnc RNA表达情况,q RT-PCR验证芯片结果;利用流式细胞术分选出BT549和Hs578T细胞中具有干性特征(CD44+/CD24-)的细胞部分,免疫印迹法检测BT549和Hs578T中干细胞(CSC)和非干细胞(non-CSC)中干性标志物(SOX2、KLF4、c-Myc)的表达;q RT-PCR检测lnc RNA408在干细胞与非干细胞中的表达;q RT-PCR检测lnc RNA408在不同代数的干性细胞球(sphere)与非干性细胞球中的表达差异;q RT-PCR检测lnc RNA408在乳腺癌患者癌和癌旁组织中的表达;q RT-PCR检测lnc RNA408在不同分级的临床乳腺癌样本中的表达。(2)利用sh RNA在BT549和Hs578T细胞中敲低lnc RNA408,q RT-PCR验证敲低效率,检测敲低lnc RNA408后CSC中干细胞成球率和成球大小的变化,q RT-PCR、免疫印迹法和免疫荧光分别检测SOX2、KLF4、c-Myc在敲低前后的CSC中表达差异;利用慢病毒包装的质粒在BT549和Hs578T中过表达lnc RNA408,q RT-PCR验证过表达效率,流式细胞术检测过表达后干性特征细胞的变化比例,检测过表达lnc RNA408后CSC中干细胞成球率和成球大小的变化,q RT-PCR、免疫印迹法分别检测SOX2、KLF4、c-Myc在过表达前后的CSC中表达差异。(3)生物信息学分析lnc RNA408在染色体上的定位,确定其邻近靶基因CBY1,并预测编码蛋白的能力,原位杂交检测lnc RNA408的亚细胞定位,q RT-PCR和免疫印迹法分别检测CBY1在lnc RNA408敲低及过表达模型中的表达差异,Kaplan-meier法分析CBY1的表达与乳腺癌预后的关系。(4)利用sh RNA在BT549和Hs578T细胞中敲低CBY1的表达,q RT-PCR和免疫印迹法验证敲低效率,检测敲低CBY1后CSC中干细胞成球率和成球大小的变化,q RT-PCR和免疫印迹法分别检测SOX2、KLF4、c-Myc在敲低前后的CSC中表达差异;在lnc RNA408敲低的细胞模型中同时敲低CBY1表达,检测CSC中干细胞成球率和成球大小的变化,q RT-PCR和免疫印迹法分别检测KLF4、c-Myc在“双敲(sh Lnc408+sh CBY1)”CSC中的表达差异。(5)生物信息学分析CBY1的蛋白互作网络,免疫共沉淀检测CBY1与14-3-3和β-catenin蛋白的互作情况,将CBY1突变后再次检测其与14-3-3和β-catenin蛋白的互作情况,免疫印迹和免疫荧光法分别检测β-catenin在CBY1敲除细胞和突变细胞模型的亚细胞定位,在CBY1敲除细胞模型中用PRI-724(β-catenin抑制剂)处理细胞,检测处理前后CSC中干细胞成球率和成球大小的变化,q RT-PCR和免疫印迹法分别检测KLF4、c-Myc在处理前后的CSC中表达差异。(6)裸鼠皮下成瘤实验确定Lnc RNA408/CBY1轴对BCSC成瘤的影响,测量各组肿瘤的体积和重量,免疫组化检测c-Myc在各组中的表达。结果:(1)lnc RNA408在EMT转变的乳腺癌细胞中高表达,并且在具有干性特征细胞(CD44+/CD24-)中表达更高;lnc RNA408在CSC中的表达高于non-CSC,且随着干细胞的连续传代,lnc RNA408的表达逐渐增加;lnc RNA408在临床乳腺癌样本中的表达高于癌旁组织,且随着乳腺癌的分级增加而逐渐升高。(2)敲低lnc RNA408后,乳腺癌干细胞成球率,成球大小明显降低,干性标志物SOX2、KLF4、c-Myc表达明显减弱;过表达lnc RNA408后,干性细胞比例增加,乳腺癌干细胞成球率,成球大小明显增加,干性标志物SOX2、KLF4、c-Myc表达明显增强。(3)lnc RNA408位于22号染色体的反义链上,生物信息预测其本身没有编码蛋白的能力,最邻近的编码基因是CBY1;原位杂交结果显示lnc RNA408定位于细胞核;敲低lnc RNA408后CBY1的m RNA和蛋白水平表达增加,过表达lnc RNA408后CBY1的m RNA和蛋白水平表达减弱,Kaplan-meier生存分析显示CBY1是一个预后较好的因子。(4)敲低CBY1后,乳腺癌干细胞成球率,成球大小明显增加,干性标志物SOX2、KLF4、c-Myc表达明显增强;同时敲低lnc RNA408和CBY1,乳腺癌干细胞成球率,成球大小无明显变化,干性标志物KLF4、c-Myc表达无显著改变。(5)CBY1的蛋白互作网络显示CBY1主要和14-3-3和β-catenin蛋白结合,敲低或者突变CBY1后均无法与14-3-3和β-catenin结合,CBY1无法与14-3-3和β-catenin结合后β-catenin的表达从胞浆转移至胞核;敲低CBY1后,干细胞成球率、成球大小明显增加,干性基因表达上调,抑制WNT通路后干细胞成球率、成球大小无明显变化,干性基因表达无显著差异。(6)lnc RNA408促进BCSC体内成瘤,促进c-Myc在瘤体内的表达,敲低CBY1促进BCSC体内成瘤,c-Myc在瘤体内表达增强。结论:(1)lnc RNA408在乳腺癌干细胞中高表达。(2)lnc RNA408促进BCSC的富集和干性维持。(3)lnc RNA408位于22号染色体反义链,无编码蛋白能力,定位于细胞核,能够抑制其邻近靶基因CBY1m RNA和蛋白的表达。(4)CBY1本身抑制BCSC的富集和干性维持,lnc RNA408通过抑制CBY1的表达来促进BCSC的富集和干性维持。(5)CBY1在细胞核内与14-3-3和β-catenin蛋白结合,将β-catenin泵出胞核,使WNT信号通路失活。(6)lnc RNA408/CBY1信号轴促进BCSC体内成瘤。
  • 【分类号】:R737.9
  • 【学位名称】:博士
  • 【导师名称】:柳满然
  • 【学位授予单位】:重庆医科大学
  • 【学位年度】:2019
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