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京尼平苷对APP/PS1小鼠行为学损伤和病理变化的保护作用及分子机制—抑制mTOR信号通路增强自噬的研究

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  • 【题名】:京尼平苷对APP/PS1小鼠行为学损伤和病理变化的保护作用及分子机制—抑制mTOR信号通路增强自噬的研究
  • 【年度】:2019
  • 【作者】:张志华
  • 【关键词】:京尼平苷  阿尔茨海默病  mTOR  自噬
  • 【摘要】:目的:大量研究(包括本实验室的前期研究)业已证明,治疗糖尿病药物,特别是肠降血糖素及其类似物能有效抑制神经退行性疾病的发生和发展。肠降血糖素主要有:胰高血糖素样多肽-1(Glucagon-like Peptide-1,GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(Glucose-dependent insulinotropic polypeptide,GIP)。京尼平苷(Geniposide)是中药栀子的主要有效成分,经高通量筛选被确认为GLP-1受体激动剂。京尼平苷对糖尿病具有很好的治疗效果,同时具有广泛的神经保护作用。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)作为营养感受器调节机体的能量平衡,与老化过程中的糖代谢紊乱、脂代谢紊乱密切相关,被认为是老化及与老化相关疾病发生发展的关键因素,与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的发生发展密切相关。m TOR信号通路是细胞自噬作用最经典的通路之一。自噬是基因调控的真核细胞降解细胞器和蛋白质的高度进化保守的过程,对维持细胞稳态有重要意义。自噬可以降解异常蛋白质,如AD病理蛋白β-淀粉样蛋白(Aβ)、Tau蛋白等。自噬减弱可能是AD发生的原因之一。因此,我们提出假说:GLP-1及京尼平苷可能通过m TOR信号通路影响自噬发挥AD保护作用,并在本研究验证之。方法:1.将APP/PS1小鼠随机分为两组:APP/PS1京尼平苷治疗组(n=15),给药京尼平苷50 mg/kg/d;APP/PS1模型对照组(n=15),给同样容积水。第三组为野生对照组(C57BL/6)(n=15),给同样容积水。各组小鼠均每天灌胃给药或给水一次,时间为每天上午8:00-9:00。连续用药6W后进行行为学测试:新事物识别(Novel Object Recognition,NOR)实验、Morris水迷宫(Morris Water Maze,MWM)实验,观察京尼平苷对APP/PS1小鼠行为学变化的影响。行为学测试期间继续给药,测试结束后,即用药8W时,将动物处死进行生物化学分析。2.应用HE染色观察京尼平苷对APP/PS1小鼠皮层、海马神经元形态、结构变化的影响。3.应用免疫组化技术,检测京尼平苷对APP/PS1小鼠皮层、海马老年斑(Senile plaques,SPs)的影响;应用ELISA方法,检测京尼平苷对APP/PS1小鼠海马可溶性Aβ1-40及Aβ1-42的影响。4.应用免疫组化技术、Western-blot方法,检测京尼平苷对APP/PS1小鼠海马自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1、p62表达的影响。5.应用Western-blot方法,检测京尼平苷对APP/PS1小鼠海马m TOR通路相关蛋白p-Akt/Akt、p-m TOR/m TOR及p-4E-BP1/4E-BP1的影响,应用Rt-PCR方法检测京尼平苷对APP/PS1小鼠海马AktmRNA、m TORmRNA及4E-BP1mRNA表达的影响。结果:1.NOR测试结果:训练阶段,各组小鼠对A1、A2两物体的探索指数(recognition index,RI)差别均无统计学意义(P>0.05)。测试阶段,APP/PS1模型对照组小鼠对新事物的RI较野生对照组小鼠显著降低(P<0.01),而APP/PS1京尼平苷治疗组小鼠对新事物的RI较APP/PS1模型对照组显著升高(P<0.05)。京尼平苷增高APP/PS1小鼠对新事物的RI。测试阶段,APP/PS1模型对照组小鼠对新事物的识别指数(discrimination index,DI)较野生对照组小鼠显著降低(P<0.001),而APP/PS1京尼平苷治疗组小鼠对新事物的DI较APP/PS1模型对照组小鼠显著升高(P<0.05)。京尼平苷增高APP/PS1小鼠对新事物的DI。2.MWM测试结果:在定位航行实验中,三组小鼠寻找水下隐藏平台的平均时间逃避潜伏期在第1天、第2天差别均无统计学意义(P>0.05),在第3天、第4天、第5天,APP/PS1模型对照组与野生对照组相比显著延长(P<0.001,P<0.001,P<0.001);而APP/PS1京尼平苷治疗组与APP/PS1模型对照组相比,在第3天、第4天差别均无统计学意义(P>0.05),在第5天显著缩短(P<0.05)。京尼平苷缩短APP/PS1小鼠寻找水下隐藏平台的时间逃避潜伏期。三组小鼠寻找水下隐藏平台的平均逃避距离在第1天、第2天差别均无统计学意义(P>0.05),在第3天、第4天、第5天,APP/PS1模型对照组与野生对照组相比显著延长(P<0.001,P<0.001,P<0.001),而APP/PS1京尼平苷治疗组与APP/PS1模型对照组相比,第3天、第4天差别均无统计学意义(P>0.05),在第5天显著缩短(P<0.05)。京尼平苷缩短APP/PS1小鼠寻找水下隐藏平台的逃避距离。各组小鼠寻找水下隐藏平台的路径记录显示:野生对照组小鼠的运动轨迹靠近平台位置,APP/PS1模型对照组小鼠的运动轨迹杂乱无章、无目的性,而APP/PS1京尼平苷治疗组小鼠的运动轨迹较APP/PS1模型对照组小鼠靠近平台位置,具有选择性。在空间探索实验中,APP/PS1模型对照组小鼠60s内穿越原平台所在象限次数较野生对照组小鼠显著减少(P<0.001),而APP/PS1京尼平苷治疗组较APP/PS1模型对照组显著增多(P<0.01)。APP/PS1模型对照组小鼠60s内在目标象限(即平台所在象限)游泳时间占总时间的百分比较野生对照组小鼠显著降低(P<0.001),而APP/PS1京尼平苷治疗组较APP/PS1模型对照组显著增高(P<0.05)。京尼平苷改善了APP/PS1小鼠的认知功能和空间记忆能力。在可视平台实验中,各组小鼠寻找可视平台的平均时间逃避潜伏期和平均游泳速度的差异均无统计学意义(P>0.05)。3.小鼠脑组织HE染色结果显示:野生对照组小鼠大脑皮层、海马神经元染色均匀,结构完整,排列整齐紧密,核圆,核膜边界清晰,核仁大而明显,无空泡或核固缩现象;APP/PS1模型对照组小鼠大脑皮层、海马神经元数量明显减少,排列紊乱、松散,有核固缩;而APP/PS1京尼平苷治疗组小鼠神经元数量较APP/PS1模型对照组明显增多,细胞层较为完整,排列较为整齐。4.小鼠脑组织老年斑(SPs)检测结果:野生对照组小鼠大脑皮层、海马均无SPs,APP/PS1模型对照组小鼠皮层、海马出现较多SPs,面积较大;而APP/PS1京尼平苷治疗组小鼠较APP/PS1模型对照组小鼠皮层、海马SPs数量减少,面积减小。经定量分析发现,APP/PS1京尼平苷治疗组较APP/PS1模型对照组斑块面积显著减小(P<0.01)、数量显著减少(P<0.05)。5.小鼠海马可溶性Aβ1-40及Aβ1-42检测结果:野生对照组小鼠海马未检出可溶性Aβ1-40及Aβ1-42,APP/PS1京尼平苷治疗组小鼠海马可溶性Aβ1-40及Aβ1-42较APP/PS1模型对照组均显著降低(P<0.05,P<0.05)。6.小鼠海马自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1、p62检测结果:免疫组化检测结果显示,APP/PS1模型对照组小鼠海马LC3-Ⅱ、Beclin1的表达较野生对照组小鼠降低,而APP/PS1京尼平苷治疗组小鼠较APP/PS1模型对照组小鼠增高。经进一步分析,与野生对照组小鼠相比,APP/PS1模型对照组小鼠海马LC3-Ⅱ、Beclin1阳性细胞数显著减少(P<0.001,P<0.001),而APP/PS1京尼平苷治疗组小鼠较APP/PS1模型对照组小鼠LC3-Ⅱ、Beclin1阳性细胞数显著增多(P<0.001,P<0.001)。Western-blot检测结果同免疫组化检测结果一致,APP/PS1模型对照组小鼠海马LC3-Ⅱ、Beclin1的表达较野生对照组小鼠显著降低(P<0.001,P<0.01),而APP/PS1京尼平苷治疗组小鼠海马LC3-Ⅱ、Beclin1的表达较APP/PS1模型对照组显著增高(P<0.05,P<0.01)。p62与自噬呈负相关,其表达与LC3-Ⅱ、Beclin1的表达结果正好相反。APP/PS1模型对照组小鼠海马p62表达较野生对照组小鼠增高,而APP/PS1京尼平苷治疗组较APP/PS1模型对照组降低。定量分析结果表明:与野生对照组小鼠相比,APP/PS1模型对照组小鼠海马p62阳性细胞数显著增多(P<0.001),而APP/PS1京尼平苷治疗组较APP/PS1模型对照组显著减少(P<0.001)。Western-blot检测结果同免疫组化检测结果一致,APP/PS1模型对照组小鼠海马p62的表达较野生对照组小鼠显著增高(P<0.001),而APP/PS1京尼平苷治疗组较APP/PS1模型对照组显著降低(P<0.01)。7.小鼠海马m TOR通路相关蛋白表达及mRNA检测结果:Western-blot检测结果显示,APP/PS1模型对照组小鼠海马p-Akt/Akt、p-m TOR/m TOR比值较野生对照组小鼠显著增高(P<0.01,P<0.05),而APP/PS1京尼平苷治疗组小鼠较APP/PS1模型对照组小鼠显著降低(P<0.05,P<0.05)。4E-BP1是m TOR的底物,APP/PS1模型对照组小鼠p-4E-BP1/4E-BP1比值较野生对照组小鼠显著降低(P<0.001),而APP/PS1京尼平苷治疗组小鼠较APP/PS1模型对照组小鼠显著增高(P<0.05)。Rt-PCR方法检测结果显示,APP/PS1模型对照组小鼠AktmRNA、m TORmRNA表达较野生对照组小鼠均显著增高(P<0.001,P<0.001),而APP/PS1京尼平苷治疗组小鼠与APP/PS1模型对照组小鼠相比,AktmRNA、m TORmRNA表达均显著降低(P<0.05,P<0.05)。APP/PS1模型对照组小鼠4E-BP1mRNA表达较野生对照组小鼠显著降低(P<0.001),而APP/PS1京尼平苷治疗组与APP/PS1模型对照组相比,4E-BP1mRNA表达显著增高(P<0.05)。结论:1.京尼平苷提高APP/PS1小鼠对新事物的识别能力,改善APP/PS1小鼠学习能力和空间记忆能力。2.京尼平苷减轻APP/PS1小鼠皮层、海马神经元的损伤。3.京尼平苷减少APP/PS1小鼠皮层、海马SPs的数量和面积,降低APP/PS1小鼠海马可溶性Aβ1-40、Aβ1-42的含量。4.京尼平苷增强自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1的表达,抑制与自噬呈负相关的蛋白p62的表达。5.京尼平苷降低m TOR信号通路p-Akt/Akt、p-m TOR/m TOR比值,增高p-4E-BP1/4E-BP1比值。6.京尼平苷降低m TOR信号通路AktmRNA、m TORmRNA的表达,增高4E-BP1mRNA的表达。7.京尼平苷可能通过抑制m TOR信号通路增强自噬从而改善APP/PS1小鼠行为学损伤,减轻其病理变化。
  • 【分类号】:R285.5
  • 【学位名称】:博士
  • 【导师名称】:李琳
  • 【学位授予单位】:山西医科大学
  • 【学位年度】:2019
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