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MitoQ对小鼠创伤性脑损伤的神经保护作用及相关机制的研究

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  • 【题名】:MitoQ对小鼠创伤性脑损伤的神经保护作用及相关机制的研究
  • 【年度】:2019
  • 【作者】:周建
  • 【关键词】:创伤性脑损伤  Mitoquinone(Mito Q)  神经保护  机制
  • 【摘要】:第一部分Mito Q在创伤性脑损伤后氧化应激中的作用及其机制氧化应激是创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)后继发性脑损伤的病理生理反应之一,本部分旨在研究Mito Q对TBI后的氧化应激作用及其可能作用机制目的:探讨创伤性脑损伤后Mito Q的神经保护作用及其对Nrf2-ARE信号通路的作用。方法:成年雄性ICR小鼠随机分为假手术组(Sham)、外伤组(TBI)、外伤+溶剂组(TBI+vehicle),外伤+Mito Q组(TBI+Mito Q)(n=30)。按照改良的Feeney法制作小鼠TBI模型,伤后24h对各组小鼠取伤灶周围皮层组织,干湿重法测定小鼠脑含水量;酶标法检测脂质过氧化产物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GPx)的含量;免疫荧光检测Nrf2在伤灶周围皮层的表达;Western blot法检测脑组织胞核、胞浆蛋白中Nrf2的表达及其下游相关基因Nqo1和HO-1的表达;Real-time PCR检测HO-1、Nqo1在m RNA水平的表达情况;结果:与Sham组相比,TBI后小鼠神经功能障碍明显,脑水肿、氧化应激水平显著增加;TBI组和TBI+vehicle组的上述指标无显著差别;给予Mito Q治疗后可以逆转上述指标。Nrf2核转移明显,其下游基因HO-1和Nqo1在蛋白和转录水平均升高,TBI激活了Nrf2-ARE信号通路,给予Mito Q后可进一步增强Nrf2-ARE通路活性。结论:TBI后,Mito Q增强了Nrf2-ARE信号通路的活性,提高机体的抗氧化应激能力,明显减轻脑水肿,改善神经功能障碍,发挥了神经保护作用。第二部分Mito Q在创伤性脑损伤后细胞凋亡中的作用及其机制细胞凋亡是TBI后继发性损伤的一个重要病理生理过程,抑制神经细胞凋亡可发挥神经保护作用。前面的研究表明Mito Q具有神经保护作用。然而,目前尚无Mito Q影响TBI后细胞凋亡的文献报道,且潜在分子机制尚不清楚。有研究表明,TBI后线粒体凋亡途径被激活,通过抑制线粒体凋亡发挥神经保护作用。本部分实验通过建立小鼠TBI模型,探讨Mito Q通过线粒体凋亡途径对神经细胞凋亡的作用及机制。目的:探讨Mito Q对TBI后通过线粒体途径的抗凋亡作用及其可能的机制。方法:成年雄性ICR小鼠随机分为假手术组(Sham)、外伤组(TBI)、外伤+溶剂组(TBI+vehicle),外伤+Mito Q组(TBI+Mito Q)(n=24)。按照改良的Feeney法小鼠制备TBI模型,伤后24h对各组小鼠取伤灶周围皮层组织,干湿重法测定脑含水量,Western blot分别检测脑组织cleaved caspase-3的表达,以及线粒体内外细胞色素c(cytochrome c)、Bax蛋白的表达,免疫组化检测caspase-3的表达,Nissl染色检测伤灶周围皮层区神经元的存活,TUNEL荧光染色检测伤灶周围神经细胞凋亡。结果:TBI+vehicle组小鼠脑含水量、cleaved caspase-3的表达、神经细胞凋亡指数显著高于Sham组,皮层神经元的存活率明显降低,TBI组和TBI+vehicle组无差别;与TBI+vehicle组比较,TBI+Mito Q组小鼠脑含水量降低,caspase-3的表达减少,神经元存活率显著升高,神经细胞凋亡指数显著降低,差异均有统计学意义。线粒体中TBI+vehicle组cytochrome c表达较Sham组明显降低,而Bax的表达则明显增加;TBI+Mito Q中cytochrome c表达较TBI+vehicle组明显增加,而Bax表达则明显减少。在去线粒体细胞质中,cytochrome c、Bax的表达则呈相反变化。结论:Mito Q在小鼠创伤性脑损伤中有保护作用,可能通过线粒体途径抑制神经细胞的凋亡。第三部分Mito Q在创伤性脑损伤后对自噬的影响及调控机制的研究研究一Mito Q在创伤性脑损伤后对自噬的影响目的:探讨TBI后Mito Q是否可以激活自噬方法:成年雄性ICR小鼠随机分为假手术组(Sham)、外伤组(TBI)、外伤+溶剂组(TBI+vehicle)、外伤+Mito Q组(TBI+Mito Q)。按照改良的Feeney法制作小鼠TBI模型,按照NSS评分标准进行神经功能评分;Western blot法检测LC3、Beclin-1的表达水平;LC3/Neu N免疫荧光观察神经细胞中自噬是否被激活。结果:TBI后小鼠皮层神经元的LC3、Beclin-1表达水平相对于Sham组明显增高,TBI后神经元中自噬体增多,神经功能障碍更为严重,给予Mito Q治疗后自噬活性明显增强,明显减轻神经功能障碍。结论:Mito Q可激活自噬改善神经功能障碍。研究二Mito Q通过调控PI3K/AKT/m TOR信号通路诱导自噬活化目的:探讨Mito Q在TBI后如何诱导自噬表达及相应的调控通路,阐明Mito Q活化自噬的机制。方法:将健康成年雄性ICR小鼠随机分为4组:Sham组,TBI组,TBI+Mito Q组,TBI+Mito Q+LY294002组(n=12/每组)。Westem blot检测Akt、p-Akt,m TOR和p-m TOR的表达及自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达。结果:TBI后小鼠脑组织中p-m TOR和p-Akt的表达水平相对于Sham组显著升高,予以Mito Q治疗后p-m TOR和p-Akt的表达水平明显下降;于侧脑室注射LY294002后,进一步下调p-m TOR和p-Akt的表达水平。与Sham组比较,TBI后挫伤周围皮层LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达水平上调,予以Mito Q治疗后LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达显著上调;与TBI+Mito Q组比较,TBI+Mito Q+LY294002组挫伤皮层周围组织中LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达量进一步增加。结论:Mito Q诱导自噬表达可能是通过调控PI3K/Akt/m TOR通路实现的。
  • 【分类号】:R651.15
  • 【学位名称】:博士
  • 【导师名称】:王汉东
  • 【学位授予单位】:南京医科大学
  • 【学位年度】:2019
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