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WWOX通过调控ERMAP基因抑制鼻咽癌细胞生长的作用及机制研究

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  • 【题名】:WWOX通过调控ERMAP基因抑制鼻咽癌细胞生长的作用及机制研究
  • 【年度】:2019
  • 【作者】:杨峥
  • 【关键词】:鼻咽癌  WWOX  过表达  基因表达谱芯片  ERMAP  RNA干扰
  • 【摘要】:【研究背景与目的】鼻咽癌是在我国南方地区高发的一种恶性的头颈部肿瘤,发病率排名位居全球第18位,其有地域集中性、发病原因复杂、发病隐匿、高度的转移和侵袭能力等显著特点,其发生发展涉及多个基因共同参与,揭示其发病机理、寻找相关新的癌基因、抑癌基因进行探索,获得新的治疗靶点,对鼻咽癌早期诊断与治疗及预后有着重要意义。WWOX是一个新的抑癌基因,于2000年首次被发现,其含有2个WW结构域与1个氧化还原酶结构,WW结构域可以调节蛋白与蛋白之间的相互作用。课题组在前期研究中检测到在鼻咽癌组织中WWOX基因的表达水平降低,且与TNM分期相关,随着疾病进展而表达逐步下降,还与淋巴结转移相关,体外实验发现WWOX可以抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁徙与侵袭,但在抑制鼻咽癌发生、发展、转移的机制和预后方面的价值作用尚未能确定。本课题拟对WWOX基因在鼻咽癌发生发展中的作用以及其下游基因对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的调控机制进行深入研究。【研究方法】1、设计、包装含有WWOX基因的慢病毒载体,将病毒转染鼻咽癌细胞株CNE-2Z并构建稳定转染后的细胞。采用Affymetrix基因表达谱芯片检测鼻咽癌细胞CNE-2Z过表达WWOX后基因组的表达差异,并利用IPA、GO等生物信息学分析软件等对差异基因进行显著性分析,进行经典信号通路的富集分析以及疾病与功能分类。通过对可能参与的调控通路及差异显基因进行筛选,揭示WWOX基因在鼻咽癌中发挥生物学功能的可能分子机制。2、在Affymetrix基因芯片发现的疑似WWOX下游鼻咽癌相关基因基础上,采用Real-time-PCR方法对筛选出的疑似基因逐一进行验证,再次筛选出下游候选基因;分别对每个候选基因设计3个干扰靶序列,构建并预混病毒,转染细胞,采用Celigo全视野细胞扫描分析仪实时监测细胞生长并进行统计分析,筛选出对细胞生长影响最显著的下游驱动基因;再次对最终候选基因进行Celigo单个靶点验证,以用于后续实验;3、根据单靶点验证后的下游候选基因序列制备RNAi慢病毒,感染细胞并构建稳定转染后的细胞系,采用Real-time PCR和Western blot方法分别检测候选基因mRNA和蛋白的变化,评估候选基因敲减效率。Celigo全视野细胞扫描分析仪实时监测下调下游候选基因后细胞生长情况;克隆形成实验检测下调候选基因后对鼻咽癌细胞增殖能力和独立生存能力的影响;MTT法检测下调候选基因对鼻咽癌细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测下调候选基因对鼻咽癌细胞早期凋亡的影响;Transwell实验检测下调候选基因对鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的影响。4、收集81例鼻咽癌患者的鼻咽部组织和40例正常鼻咽部上皮组织标本,应用Real-time PCR和免疫组织化学染色方法比较鼻咽癌组织和正常鼻咽部组织中下游候选基因的表达差异,分析候选基因蛋白表达量与鼻咽癌患者临床病理特征之间的联系。【结果】1、过表达WWOX后基因表达谱芯片初步筛选出差异表达基因1112个,其中上调基因772个,下调基因340个。差异基因的通路富集分析显示WWOX主要影响包括Role of BRCA1 in DNA Damage Response、Estrogen-mediated S-phase Entry、Protein Kinase A Signaling通路在内的多个经典信号通路的状态。差异基因主要在涉及在proliferation of cells、ViralInfection和organismal death等疾病和功能中发挥作用。进一步利用IPA、GO分析发现差异表达基因关联到多个恶性肿瘤相关的生物学进程,并参与到肿瘤的发生和发展。2、在分析基因芯片得到的大量基因数据结果基础上,利用生物信息学的方法筛选在肿瘤中研究较少,且在鼻咽癌中未曾报道过的基因,以可能影响肿瘤细胞增殖为筛选条件,通过基因芯片得出的下调基因P-value排序,挑选出30个候选基因;将稳定转染过表达WWOX基因的细胞株通过RT-PCR检测候选基因的表达情况,观察显著相关的下游基因。得到7个显著下调候选基因,因此对7个下游候选基因进行功能学筛选。对每个下游候选基因分别设计3个干扰靶点,得到混合靶点的RNAi慢病毒,并转染到CNE-2Z细胞,以保证干扰效率。通过Celigo全视野细胞扫描分析仪实时检测的方法,在7个候选基因中发现ERMAP基因能够显著影响CNE-2Z细胞增殖能力。并进一步通过Celigo对ERMAP单靶点进行验证,得到抑制增殖最显著的干扰序列shERMAP(55086),以备后续实验。3、ERMAP mRNA和蛋白在鼻咽癌细胞株中相对高水平表达,通过RNAi慢病毒敲减ERMAP后mRNA和蛋白表达水平显著下调,Celigo实时监测细胞增殖发现,培养第5天对照组细胞数量为6623±407个,干扰组细胞数量为682±36个,下调ERMAP后细胞增殖能力减弱,细胞克隆实验发现,培养15天对照组克隆数为188±4个,干扰组克隆为20±1个,敲减ERMAP后抑制了细胞克隆形成;MTT实验显示培养5天对照组细胞增殖倍数为7.603±0.1471,干扰组增殖倍数为2.197±0.1579,CNE-2Z的增殖活性显著受到了抑制;流式细胞术检测发现,敲减ERMAP能够使得细胞凋亡率明显增加;transwell实验显示,细胞的迁移能力受到了显著的抑制。4、正常鼻咽部组织和鼻咽癌组织中ERMAP的mRNA表达分别为0.3395±0.188、1.050±0.609,鼻咽癌组织中ERMAP的mRNA表达较正常鼻咽部组织明显增高(P<0.05)差异有统计学意义。40例正常鼻咽部组织中ERMAP免疫组化结果的平均积分5.63±2.47,81例鼻咽癌组织中ERMAP免疫组化结果的平均积分8.28±3.50,鼻咽癌组织ERMAP蛋白表达明显高于正常鼻咽部组织,差异有统计学差异。定量分析比较ERMAP表达与鼻咽癌患者临床病理特征之间的联系。结果显示,ERMAP表达与患者临床分期相关,Ⅰ、Ⅱ期的患者ERMAP的表达高于III、IV期患者。ERMAP表达与鼻咽癌患者的性别、年龄、组织病理类型、T分期、淋巴结转移与否之间无显著相关性。【结论】1、在鼻咽癌细胞中WWOX基因涉及到最显著的3个肿瘤相关通路Role of BRCA1 in DNA Damage Response、Estrogen-mediated S-phase Entry、Protein Kinase A Signaling可能发挥抑癌功能。2、ERMAP基因表达下调能抑制鼻咽癌细胞的增殖、克隆及迁移能力。3、ERMAP在鼻咽癌中的表达高于正常鼻咽部组织,并且与肿瘤TNM分期可能相关,ERMAP在鼻咽癌中可能发挥着促进肿瘤发生发展的作用。
  • 【分类号】:R739.63
  • 【学位名称】:博士
  • 【导师名称】:莫武宁
  • 【学位授予单位】:广西医科大学
  • 【学位年度】:2019
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